Disulfidirikkaiden proteiinien heterologinen tuotanto ja rakenteelliset tutkimukset

Escherichia coli (E. coli) -bakteeria pidetään yleisesti yhtenä parhaista solutehtaista eukaryoottirekombinanttiproteiinien tuotantoon. Disulfideja sisältävien proteiinien tuotanto bakteereissa kuten E. colissa on kuitenkin aina ollut haasteellista. Proteiinien tuottumista liukenemattomassa muodossa on pyritty ratkaisemaan useilla eri menetelmillä, muun muassa käyttäen hyväksi eri E. coli -kantoja, kaperonien samanaikaista tuottoa ja matalaa tuottolämpötilaa. CyDisCo (cytoplasmic disulfide bond formation in E. coli) -teknologian kehityksen myötä disulfidirikkaiden eukaryoottiproteiinien tuotanto E. colin sytoplasmassa on tehostunut. CyDisCo-teknologia perustuu kahden avustavan komponentin tuottamiseen joko ennen tai samanaikaisesti kohdeproteiinin kanssa: sulfhydryylioksidaasi muodostaa uusia disulfidisidoksia ja proteiinidisulfidi-isomeraasi katalysoi disulfidisidosten isomerisaatiota.
Tässä tutkimuksessa CyDisCo-teknologian kapasiteettia E.colissa testattiin tuottamalla erilaisia tyvikalvoproteiineja. Tutkittaviin tyvikalvoproteiineihin kuuluivat muun muassa perlekaani, nidogeeni-2 ja fibuliini-2. Muita tutkittavia disulfideja sisältäviä proteiineja olivat PDGF-BB-kasvutekijä ja entsyymit CalB and MTP. Tutkimuksen perimmäinen tavoite oli ymmärtää näiden proteiinien biologinen merkitys ratkaisemalla niiden atomitason rakenteet röntgensädekristallografialla.
Tyvikalvoproteiineja on tutkittu paljon solutasolla. Valitettavasti atomitason rakenteellista tietoa niille on saatavilla vain vähän. Tämä johtuu osaltaan siitä, että kyseiset proteiinit sisältävät paljon disulfidisidoksia. Tutkimuksessa tyvikalvoproteiinit jaettiin fragmentteihin, ja niiden tuotanto suoritettiin E. colissa käyttäen CyDisCo-menetelmää. Onnistuneesti liukoisesti tuotetut osat kattoivat 84 % (perlekaani), 32 % (nidogeeni-2) ja 61 % (fibuliini-2) täysimittaisista proteiineista, sisältäen vastaavasti 83 %, 40 % ja 79 % täysimittaisten proteiinien disulfidisidoksista. Puhdistetut proteiinit analysoitiin erilaisilla biokemiallisilla, biofysikaalisilla ja rakennebiologian menetelmillä. Esimerkkinä erinomaisista saavutuksista on hiiren 130 kDa kokoisen ja 44 disulfidia sisältävän perlekaanin 3. alueen (aminohapot G503-T1672) liukoinen tuotto E. colissa CyDisCo-teknologian avulla. Lisäksi tutkimuksessa ratkaistiin ensimmäistä kertaa perlekaanin 3. alueen ~40 kDa suuruisen fragmentin sekä 17 disulfidia sisältävän 26 kDa suuruisen fibuliini-2:n homodimeerin kiderakenteet sekä tuotettiin onnistuneesti muita disulfideja sisältäviä eukaryoottiproteiineja kuten MTP, CalB ja PDGF-BB. Nämä vaiheet sisälsivät entsyymien rakenne-funktiotutkimuksia.