Geneettisten varianttien funktionaalisten vaikutusten selvittäminen syöpäalttiuteen ja sen etenemiseen bioinformatiikan keinoin
Väitöstilaisuuden tiedot
Väitöstilaisuuden päivämäärä ja aika
Väitöstilaisuuden paikka
F101 (Aapistie 7A)
Väitöksen aihe
Geneettisten varianttien funktionaalisten vaikutusten selvittäminen syöpäalttiuteen ja sen etenemiseen bioinformatiikan keinoin
Väittelijä
MSc Qin Zhang
Tiedekunta ja yksikkö
Oulun yliopiston tutkijakoulu, Biokemian ja molekyylilääketieteen tiedekunta, Disease Networks
Oppiaine
Biokemia ja molekyylilääketiede
Vastaväittäjä
Professori Matti Nykter, Tampereen yliopisto
Kustos
Professori Gonghong Wei, Oulun yliopisto
Geneettisten varianttien funktionaalisten vaikutusten selvittäminen syöpäalttiuteen ja sen etenemiseen bioinformatiikan keinoin
Syöpä on geneettinen sairaus, jolle on tyypillistä epänormaali ja hallitsematon solujakautuminen. Lopulta se tunkeutuu ympäröiviin kudoksiin ja metastasoi muihin kudoksiin ja elimiin. Genominlaajuisten assosiaatiotutkimusten (GWAS) avulla on havaittu 900 syöpäriskiin vaikuttavaa yhden nukleotidin variaatiota (eng. single nucleotide polymorphism; SNP) monille eri syöpätyypeille. Suurin osa näistä GWAS lokuksista pitää sisällään niin sanottuja cis-säätelyalueen elementtejä (engl. cis-regulatory elements; CRE). Nämä elementit vaikuttavat usein kohdegeenien ilmentymiseen, lisäten syöpäalttiutta ja edistäen kasvaimen kehittymistä. Kaikista syöpätyypeistä eturauhassyöpä on toiseksi yleisimmin diagnosoitu pahanlaatuinen syöpä miehillä ja viidenneksi yleisin miesten syöpäkuolemien aiheuttaja maailmanlaajuisesti. Geneettiset tekijät selittävät 57% eturauhassyöpäalttiudesta, eli niillä sen on perustavanlaatuinen rooli sen tautiriskissä. GWAS-analyysit ovat tunnistaneet yli 300 genomialuetta, joissa on yli 1000 eturauhassyövän riskiin ja/tai sen aggressiivisuuteen liittyvää SNP:iä. Tällä hetkellä tutkijoilla on kuitenkin vain rajallinen ymmärrys näiden GWAS:ien avulla löydettyjen SNP-lokusten taustalla olevista molekyylitason mekanismeista kuinka ne lisäävät syöpäalttiutta ja edistävät sen etenemistä. Ihmisen genomin säätelyn monimutkaisuuden takia suurin osa riski-SNP:eistä sijaitsee ei-proteiinia koodaavilla alueilla, usein geenien säätelyelementeissä, mikä tekee niiden taustalla olevien biologisten mekanismien selvittämisestä haastavaa. Koska sekvenssispesifiset DNA:han sitoutuneet proteiinit, transkriptiotekijät (TF), tunnistavat yleensä tietyn 6–10 nukleotidin signaalin, oletimme geenien säätelyelementteihin sisältyvien SNP:ien voivan vaikuttaa keskeisten transkriptiotekijöiden sitoutumiseen kromatiiniin. Tämä puolestaan voi johtaa syöpään liittyvien geenien poikkeavaan ilmentymiseen ja siten lisätä syöpäalttiutta.
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli priorisoida laajoista GWAS-tuloksista todennäköisimmät funktionaaliset syöpäriskiä lisäävät variantit, mikä helpottaisi näiden riski-SNP:ien säätelymekanismien tutkimista johtaen mahdollisesti uusiin avauksiin ja kliinisiin sovelluksiin. Kehitimme bioinformatiivisen analyysityökalun funktionaalisten SNP-varianttien seulomiseksi ja syöpäalttiuden geenisäätelymekanismien taustoittamiseksi. Analyysi integroi kromatiiniin sitoutuvien transkriptiotekijöiden määritykseen (ChIP-Seq) perustuvaa genominlaajuista niin sanottua kistromi- ja epigenomidataa, joka koostuu useista eri lähteistä saaduista genotyyppi- ja geeniekspressiodatasta, sekä normaalien kudosten ja kasvainnäytteiden geeniekspressiodatasta erityyppisistä syövistä. Geenitasolla tämä analyysi paljasti joukon useissa syövissä esiintyviä eQTL-geenejä, jotka olivat merkittävästi rikastuneet proteiini-proteiini-vuorovaikutusverkostoissa. Karakterisoidut syövissä yleiset SNP:t olivat erittäin rikastuneita aktiivisilla tehostaja (engl. enhancer)- tai supertehostaja-alueilla. Analyysi priorisoi kymmeniä kausaalisia SNP:ejä, jotka voivat muokata transkriptiotekijöiden sitoutumista kromatiiniin ja siten vaikuttaa kohdegeenin ilmentymiseen. Bioinformatiivisten syötteiden avulla validoimme viisi ennustettua eturauhassyöpäriskiin liittyvää säätelylokusta ja kohdegeeniä: rs3217869/CCND2 at 12p13, rs2853669/TERT at 5p15, useita kausaalisia SNP:ejä 17q12/HNF1B lokuksessa, funktionaalisia SNP:ejä 17p13.3/VPS53/FAM57A/GEMIN4 lokuksessa, ja rs339331/RFX6:n 6q22:ssa. Havaitsimme, että eQTL:t, mukaan lukien rs3217869 tai rs2853669, SNP:t 17q12/HNF1B-lokuksessa ja rs339331/6q22, altistavat eturauhassyövälle vaikuttamalla spesifisten kohdegeenien ilmentymiseen riskialleeli-spesifisellä tavalla. Riskivariantti rs3217869 CCND2:ssa assosioitui solun RTK/ERK-reittiin ja liittyi eturauhassyövän aggressiivisuuteen. Riskialleeli A liittyi CCND2:n ilmentymisen vähentymiseen, ja CCND2:n vaimennussäätely taas korreloi eturauhassyövän etenemiseen ja etäpesäkkeiden muodostumiseen. Selvitimme myös TERT-promoottorialueella sijaitsevan SNP:n, rs2853669:n taustalla olevia mekanismeja. Useissa monen kohortin assosiaatiotutkimuksissa havaittiin, että rs2853669:n muunnokset lisäävät eturauhassyövän riskiä eri etnisissä ryhmissä. Mekanistisesti rs2853669 vaikutti alleelispesifisesti E2F1:en ja MYC:n kromatiiniin sitoutumiseen eri androgeenitasoilla, edistäen näin eturauhassyövän etenemistä. Tehostettu E2F1:n sitoutuminen rs2853669:n C-alleeliin androgeenivajauksessa aktivoi TERT:n, kun taas androgeenistimulaatio edisti MYC:n sitoutumista T-alleeliin rs2853669:ssa, mikä lisäsi TERT:n ilmentymistä ja mahdollisesti johti vakavaan eturauhassyöpään.
GWAS-analyysit ovat osoittaneet 17q12/HNF1B-syöpäriski-lokuksen merkityksen useissa syöpätyypeissä. Selvitimme perinnöllisten varianttien ja somaattisten mutaatioiden vuorovaikutuksia tässä lokuksessa, mitkä vaikuttavat eturauhassyövän etenemiseen TMPRSS2-ERG:n ja HNF1B-yhteisvaikutuksen kautta. Kattavat bioinformaattiset ja funktionaaliset kokeet vahvistivat, että useat 17q12 kausaaliset SNP-variantit, jotka sijaitsevat HNF1B:n välittömässä läheisyydessä ja muuttavat HNF1B:n ilmentymistä TMPRSS2-ERG-fuusio-proteiinista riippuvalla tavalla. Lisäksi löysimme toisen eturauhassyöpäriskiä lisäävän lokuksen, 17p13.3 VPS53/FAM57A/GEMIN4:n, joka on osa HNF1B:n ja ERG:n syöpäriskiä lisäävää geenisäätelymekanismia. SNP-priorisointi analyysimme paljasti myös erillisen geenisäätelymekanismin rs339331/6q22-lokuksen taustalla, joka toimii GATA2-pioneeritranskriptiotekijän välityksellä. Systemaattinen bioinformatiikka-analyysimme osoitti, että GATA2-tuoton lisääntyminen liittyy eturauhassyövän etenemiseen ja huonoon ennusteeseen. Proteiini-proteiini-vuorovaikutusverkosto ja kokeelliset analyysit tunnistivat SMAD4:n, TGFβ-signalointireitin keskeisen välittäjän, GATA2:n vuorovaikutuskumppaniksi. Sekä SMAD4 että GATA2 ovat välttämättömiä eturauhassyöpäsolujen kasvulle ja selviytymiselle. Osoitimme rs339331:n T-riskialleelin tehostavan GATA2:n ja SMAD4:n kromatiiniin sitoutumista, mikä johtaa lisääntyneeseen RFX6:n ilmentymiseen. Tämä taas assosioituu eturauhassyöpäsolujen kasvuun ja kasvaimen etenemiseen.
Yhteenvetona, kehitimme bioinformatiivisen SNP-analyysin priorisoidaksemme SNP-variantteja hyödyntämällä saatavilla olevaa genomidataa sekä eri syöpäanalyyseistä saatua GWAS-assosiaatiotietoa. Integroidun analyysin avulla selvitimme, kuinka genomin SNP-variaatiot vaikuttavat syöpäalttiuteen erilaisten geenisäätelymekanismien kautta ja tunnistimme relevantit kohdegeenit, joiden syöpärelevanssin testasimme toiminnallisissa kokeissa. Selvitimme kattavasti viiden eturauhassyöpäriskiin liittyvän genomilokuksen molekyylimekanismit, jotka vaikuttavat syöpäalttiuteen ja aggressiivisuuteen. Tulokset auttavat uusien biomarkkerien ja lääkeaine-kohdeproteiinien tunnistamisessa hyödyntäen eturauhassyöpädiagnoosien ja -hoitojen kehittämistä tulevaisuuden personoidun lääketieteen edellytysten parantamiseksi.
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli priorisoida laajoista GWAS-tuloksista todennäköisimmät funktionaaliset syöpäriskiä lisäävät variantit, mikä helpottaisi näiden riski-SNP:ien säätelymekanismien tutkimista johtaen mahdollisesti uusiin avauksiin ja kliinisiin sovelluksiin. Kehitimme bioinformatiivisen analyysityökalun funktionaalisten SNP-varianttien seulomiseksi ja syöpäalttiuden geenisäätelymekanismien taustoittamiseksi. Analyysi integroi kromatiiniin sitoutuvien transkriptiotekijöiden määritykseen (ChIP-Seq) perustuvaa genominlaajuista niin sanottua kistromi- ja epigenomidataa, joka koostuu useista eri lähteistä saaduista genotyyppi- ja geeniekspressiodatasta, sekä normaalien kudosten ja kasvainnäytteiden geeniekspressiodatasta erityyppisistä syövistä. Geenitasolla tämä analyysi paljasti joukon useissa syövissä esiintyviä eQTL-geenejä, jotka olivat merkittävästi rikastuneet proteiini-proteiini-vuorovaikutusverkostoissa. Karakterisoidut syövissä yleiset SNP:t olivat erittäin rikastuneita aktiivisilla tehostaja (engl. enhancer)- tai supertehostaja-alueilla. Analyysi priorisoi kymmeniä kausaalisia SNP:ejä, jotka voivat muokata transkriptiotekijöiden sitoutumista kromatiiniin ja siten vaikuttaa kohdegeenin ilmentymiseen. Bioinformatiivisten syötteiden avulla validoimme viisi ennustettua eturauhassyöpäriskiin liittyvää säätelylokusta ja kohdegeeniä: rs3217869/CCND2 at 12p13, rs2853669/TERT at 5p15, useita kausaalisia SNP:ejä 17q12/HNF1B lokuksessa, funktionaalisia SNP:ejä 17p13.3/VPS53/FAM57A/GEMIN4 lokuksessa, ja rs339331/RFX6:n 6q22:ssa. Havaitsimme, että eQTL:t, mukaan lukien rs3217869 tai rs2853669, SNP:t 17q12/HNF1B-lokuksessa ja rs339331/6q22, altistavat eturauhassyövälle vaikuttamalla spesifisten kohdegeenien ilmentymiseen riskialleeli-spesifisellä tavalla. Riskivariantti rs3217869 CCND2:ssa assosioitui solun RTK/ERK-reittiin ja liittyi eturauhassyövän aggressiivisuuteen. Riskialleeli A liittyi CCND2:n ilmentymisen vähentymiseen, ja CCND2:n vaimennussäätely taas korreloi eturauhassyövän etenemiseen ja etäpesäkkeiden muodostumiseen. Selvitimme myös TERT-promoottorialueella sijaitsevan SNP:n, rs2853669:n taustalla olevia mekanismeja. Useissa monen kohortin assosiaatiotutkimuksissa havaittiin, että rs2853669:n muunnokset lisäävät eturauhassyövän riskiä eri etnisissä ryhmissä. Mekanistisesti rs2853669 vaikutti alleelispesifisesti E2F1:en ja MYC:n kromatiiniin sitoutumiseen eri androgeenitasoilla, edistäen näin eturauhassyövän etenemistä. Tehostettu E2F1:n sitoutuminen rs2853669:n C-alleeliin androgeenivajauksessa aktivoi TERT:n, kun taas androgeenistimulaatio edisti MYC:n sitoutumista T-alleeliin rs2853669:ssa, mikä lisäsi TERT:n ilmentymistä ja mahdollisesti johti vakavaan eturauhassyöpään.
GWAS-analyysit ovat osoittaneet 17q12/HNF1B-syöpäriski-lokuksen merkityksen useissa syöpätyypeissä. Selvitimme perinnöllisten varianttien ja somaattisten mutaatioiden vuorovaikutuksia tässä lokuksessa, mitkä vaikuttavat eturauhassyövän etenemiseen TMPRSS2-ERG:n ja HNF1B-yhteisvaikutuksen kautta. Kattavat bioinformaattiset ja funktionaaliset kokeet vahvistivat, että useat 17q12 kausaaliset SNP-variantit, jotka sijaitsevat HNF1B:n välittömässä läheisyydessä ja muuttavat HNF1B:n ilmentymistä TMPRSS2-ERG-fuusio-proteiinista riippuvalla tavalla. Lisäksi löysimme toisen eturauhassyöpäriskiä lisäävän lokuksen, 17p13.3 VPS53/FAM57A/GEMIN4:n, joka on osa HNF1B:n ja ERG:n syöpäriskiä lisäävää geenisäätelymekanismia. SNP-priorisointi analyysimme paljasti myös erillisen geenisäätelymekanismin rs339331/6q22-lokuksen taustalla, joka toimii GATA2-pioneeritranskriptiotekijän välityksellä. Systemaattinen bioinformatiikka-analyysimme osoitti, että GATA2-tuoton lisääntyminen liittyy eturauhassyövän etenemiseen ja huonoon ennusteeseen. Proteiini-proteiini-vuorovaikutusverkosto ja kokeelliset analyysit tunnistivat SMAD4:n, TGFβ-signalointireitin keskeisen välittäjän, GATA2:n vuorovaikutuskumppaniksi. Sekä SMAD4 että GATA2 ovat välttämättömiä eturauhassyöpäsolujen kasvulle ja selviytymiselle. Osoitimme rs339331:n T-riskialleelin tehostavan GATA2:n ja SMAD4:n kromatiiniin sitoutumista, mikä johtaa lisääntyneeseen RFX6:n ilmentymiseen. Tämä taas assosioituu eturauhassyöpäsolujen kasvuun ja kasvaimen etenemiseen.
Yhteenvetona, kehitimme bioinformatiivisen SNP-analyysin priorisoidaksemme SNP-variantteja hyödyntämällä saatavilla olevaa genomidataa sekä eri syöpäanalyyseistä saatua GWAS-assosiaatiotietoa. Integroidun analyysin avulla selvitimme, kuinka genomin SNP-variaatiot vaikuttavat syöpäalttiuteen erilaisten geenisäätelymekanismien kautta ja tunnistimme relevantit kohdegeenit, joiden syöpärelevanssin testasimme toiminnallisissa kokeissa. Selvitimme kattavasti viiden eturauhassyöpäriskiin liittyvän genomilokuksen molekyylimekanismit, jotka vaikuttavat syöpäalttiuteen ja aggressiivisuuteen. Tulokset auttavat uusien biomarkkerien ja lääkeaine-kohdeproteiinien tunnistamisessa hyödyntäen eturauhassyöpädiagnoosien ja -hoitojen kehittämistä tulevaisuuden personoidun lääketieteen edellytysten parantamiseksi.
Viimeksi päivitetty: 1.3.2023