Muokattujen vasta-aineformaattien tuottaminen Escherichia colin sytoplasmassa

Proteiinien hapettumiseen perustuvassa laskostumisprosessissa muodostuu rikkisiltoja, joiden avulla proteiini saadaan luonnolliseen ja biologisesti aktiiviseen toiminnalliseen muotoonsa. Rikkisiltojen muodostuminen, yksi keskeinen proteiinien posttranslationaalinen modifikaatio, on elintärkeä monien proteiinien laskostumisen, vakauden ja toiminnan kannalta. Monet kaupallisesti ja terapeuttisesti merkitykselliset rekombinanttiproteiinit, mukaan lukien kaikki vasta-ainemolekyylit, edellyttävät rikkisidosten muodostumista saavuttaakseen oikean, toiminnallisen, kolmiulotteisen muotonsa.

Rikkisidoksia sisältävien rekombinanttiproteiinien tuottaminen E. coli bakteerissa on usein haastavaa, koska proteiini on ohjattava periplasmaan rikkisidosten muodostumista varten. Aiemmin on raportoitu CyDisCo nimisestä menetelmästä, jossa sulfhydryylioksidaasi ja proteiinidisulfidi-isomeraasi entsyymejä tuotetaan solulimassa yhdessä kohdeproteiinin kanssa bakteerin luonnollisten pelkistymisreittien säilyessä ennallaan. Tämän menetelmän on laajalti todistettu auttavan rikkisidosten muodostamisessa E. colin solulimassa. Tämän tutkimuksen pääpaino oli tutkia ja ratkaista rajoittavia tekijöitä, jotka liittyvät erilaisten vasta-ainemolekyylien tuotantoon CyDisCo-menetelmää käyttäen E. colin solulimassa.

Määritimme rajoittavat tekijät, jotka liittyvät erittäin monimutkaisten terapeuttisten rekombinanttiproteiinien eli Fc-fuusioproteiinien tuottamiseen liukoisessa muodossa CyDisCo-menetelmän avulla. Kyseisten proteiinin rikkisiltojen hapettumisasteen vaihtelun syy tunnistettiin ja järjestelmällisen lähestymistavan avulla löydettiin olosuhteet, jotka johtivat kohdeproteiinien tuottamiseen yhdessä homogeenisessa hapettumisasteessa. Lisäksi osoitimme, että neutraloivia vasta-ainemolekyylejä, mukaan lukien parannetun affiniteetin omaavia muunnoksia, sekä SARS-CoV-2-varianttien reseptoriin sitoutuvaa alayksikköä voidaan tuottaa liukoisena, luonnolliseen muotoonsa laskostuneena ja toiminnallisesti aktiivisena CyDisCo-menetelmää käyttäen.

Edellä mainituista tutkimuksista saatujen tulosten perusteella kehitimme uudenlaisen ja vaihtoehtoisen vasta-ainemolekyylin muodon "FabH3", jonka avulla voimme ratkaista tiettyjä keskeisiä rajoituksia, jotka liittyvät vastaainemolekyylien laskostumiseen ja tuottamiseen E. coli -bakteerissa. Osoitimme, että tätä vaihtoehtoista vasta-ainemolekyyliä voidaan tuottaa tehokkaasti E. coli bakteerin solulimassa CyDisCo-menetelmällä luonnolliseen muotoonsa laskostuneena liukoisen saannon ollessa suurempi kuin Fab-vasta-aineen ja sitoutumisaffiniteetin kohdeantigeeniä kohtaan säilyessä samankaltaisena.